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使用液相色譜柱的十個誤區


誤區一:HPLC色譜柱不能反轉使用


觀點錯誤!實際上HPLC色譜柱的填裝壓力比最大使用壓力高很多(通常會高2倍)。如果裝柱時使用了恰當的勻漿劑,并且分配一定的時間使柱床穩定,一支填裝良好的色譜柱是完全可以雙向使用的。需要反向使用色譜柱的情況包括:柱轉換時的反沖、柱頭被強保留物質吸附污染的色譜柱(反沖的沖洗路徑更短更合理)、沖洗殘留在篩板上的顆粒物以降低柱壓或防止柱壓升高。


反向使用色譜柱有一個例外,就是生產商在色譜柱的進樣端使用了孔徑更大篩板的情況,反向使用可能會將填料從柱床沖出。色譜柱在工廠填裝時,出口端的篩板孔徑必須比色譜柱中最小顆粒的粒徑還要小。譬如,色譜填料平均粒徑是5μm,粒徑分布范圍是3–7μm,出口端篩板孔徑必須小于3μm,使填料沒有可能從柱床跑到色譜柱篩板外面。大多數生產廠家選擇的篩板孔徑是2μm。


Q:為什么有些色譜柱生產廠家會選擇入口端和出口端采用不同孔徑的篩板呢?


A:很簡單,孔徑大的篩板相對孔徑小的篩板不容易堵,一個0.5μm的篩板會比一個2μm的篩板被堵得快。所以為了避免柱壓上升過快和客戶的抱怨,生產商會折中地選擇在入口端用一個孔徑稍大的篩板,通常色譜柱上就會標一個箭頭表示只能在一個方向使用。在反向使用HPLC色譜柱時,最好仔細看一下說明書或者咨詢一下色譜柱生產廠家是否能反向使用。


備注:色譜柱反方向沖洗之前,一定要將色譜柱返接,不連接檢測器沖洗一段時間。以防有雜質將流通池堵住。一般情況下,正常色譜柱反方向沖洗后應保持反方向使用。



誤區二:所有的C18(L1)柱是一樣的


觀點錯誤!在HPLC發展初期,十八烷基硅烷(常被稱為ODS或C18)是最早的鍵合固定相之一,也導致了“反相色譜”這個新技術的誕生。C18成為了反相色譜的標準固定相并被大部分色譜工作者所采用。


制藥工業是HPLC技術的最早使用者,監管部門不想偏袒任何一家色譜柱生產廠商的品牌名字,FDA和USP編寫了一套分類體系,給每一種藥物應用方面的新方法一個通用名稱。對HPLC色譜柱,命名為“L1”C18,因為出現在大部分送審材料中,理所當然就成為了“L1。隨著別的種類固定相的增加,分別都有了自己的“L序列號(如:”L7是C8,L10是CN基,L11是苯基等等)。很不幸,這個命名體系被證明是不可靠的。因為每種商品化的C18色譜柱,雖然同樣是選用硅膠作為基體,但各自都有自己特定的填料鍵合合成工藝,因此色譜性能也不相同。譬如,有的生產廠商采用十八烷基一氯硅烷鍵合試劑和低表面積的硅膠,而其它一些廠家采用同一硅烷試劑但選用了表面積更高的硅膠基體。這兩種C18柱表現的色譜性能不同,后者C18固定相的鍵合比例大于前者。



誤區三:保護柱不影響分離效果


觀點錯誤!首先,配一個保護柱是個好主意。如果保護柱的式樣或固定相選擇錯誤,保護柱也能夠對分離效果有很大影響。要明確的是:保護柱是保護分析柱避免強保留的組分、顆粒物和其它一些不需要的東西污染用的。保護柱比起分析柱便宜許多,所以污染的保護柱替換更勤。理想的情況是,保護柱的固定相和分析柱恰好相同。如果固定相保留強(如高載碳量和混合相),甚至導致不同的選擇性。如果保留弱,問題就不那么明顯,除非固定相影響整個體系選擇性。為了使保護柱最小化的影響分離,保護柱需要合適的裝配。顯然,保護柱安插在進樣口和分析柱之間,但是如果管路太長(太長或者內徑太大),就會造成額外的峰展寬,從而影響分離。


系統引入整合保護柱(保護柱直接接在色譜柱上),從以往的報道看,基本上會達到分析柱的最佳水平。但是,整合保護柱通常和卡式色譜柱一起使用,目前已不是那么流行。不管采用什么形式的保護柱,都應當在不影響操作的前提下容易從HPLC系統中卸下和更換。理論上,接上保護柱延長了分析柱的柱長,會增加柱效和色譜分離效果。但由于上面討論中的一些因素的影響,增加保護柱只能維持原來的色譜分離性能在最佳水平,有時候甚至會變差。使用保護柱的好處是延長柱壽命,而非提高整體色譜分離效果。



誤區四:提高溫度往往有利于分離效果


觀點錯誤! 隨著溫度升高,流動相粘度下降,因此分析物傳質速率提高,所以就能夠提供更好的色譜分離效果。除了柱效,溫度同樣影響保留因子(k)和選擇性(α),溫度的變化因素能夠提高或降低分辨率(其實這也是色譜分析最關心的問題)。保留時間往往隨著溫度升高而降低,因為溫度作為一個熱力學參數,使得高溫度下分析物傾向于留在流動相中,會更快的從柱子上洗脫下來。然后,不同的化合物可能對溫度變化有不同響應程度的保留時間改變。更加確切的說,它們的范德霍夫線的斜率不同(lnk與1/T,T以絕對溫度計量);換句話說,α值會變化。另外溫度增加會使低k值的色譜峰出峰更快,甚至接近在無保留物質t0附近出來,導致很難進行定量分析。


以analgesics(一種鎮痛藥,譯者注)為例,圖二顯示的一系列的色譜圖列出了七種鎮痛藥在柱溫20-90°C的分離情況。我們從中可以發現許多特點。首先,所有分析物隨著溫度升高,保留時間變短且峰變窄,意味溫度升高利于分離效果。其次,鎮痛藥之一的水楊酸(即阿司匹林)在峰5,6之間,隨著溫度變化位置改變較大。事實是在20-40°C時,該物質隨溫度變化,洗脫順序也發生了變化。在中間的30℃時,水楊酸和第6號峰的非那西丁一起出峰。


所以,溫度大于40°C會引起分離時間變短和洗脫順序發生變化。當然,一個提高溫度的好處在于降低了操作時的柱壓,以便于使用更大的流速和粒徑更小的填料。另一個在高溫下能夠導致色譜柱性能問題的因素是流動相的溫差。如果柱子在60°C下操作,但是流動相在室溫流入,那么進入的較冷的流動相就能夠引起峰變形,原因是不同溫度下分析物會趨向在高溫的流動相中。所以建議大家在較高溫度下使用色譜柱的時一定記得預熱流動相。



誤區五:碳載量越高,反相色譜柱就越好


觀點錯誤!談到普通的烷基鍵合相時,這樣的結論看來是對鏈長、載碳量和表面鍵合度等概念有誤解。通常,對一個真正的反相保留機制來說,保留能力取決于被分析分子的相對疏水性,所以保留一般取決于載碳量。載碳量越高,保留能力越強。載碳量一般與鏈長成正比,但并不是必然如此。


典型的色譜硅膠表面,可用于和有機硅烷試劑鍵合反應的硅醇含量在8.0μmol/m2左右。假設在所有的硅醇基上都能實現單層鍵合,則鏈長越長,載碳量就越大,結果是保留能力與鏈長成正比。短鏈鍵合相(比如C8),如果表面鍵合度相對更高,那么鍵合的碳就會更多,就會導致可能比C18有更加強的保留能力。


此外,一些廠家使用二氯硅烷和三氯硅烷做鍵合試劑,由于聚合反應的發生通常能增加固定相的鍵合率。這種情況下,短鏈聚合鍵合相會比長鏈單體鍵合相的鍵合度高很多。對比單體鍵合相,聚合物鍵合相的鍵合層較厚,有時會引起傳質速度變慢。高載碳量的反相柱更加容易發生相塌陷。對于這些色譜柱,當流動相中有機相比例降到10%以下的時候,疏水固定相之間就會傾向于互相結合(self-associate),而不是處于在極性水溶液中的溶解狀態(即相似相溶)。所以,高碳載量反而可能對反相色譜性能有害,而且保留時間的重現性也不好。



誤區六:小粒徑色譜柱一定有更高的分離效果


觀點錯誤!對于一個裝填良好的色譜柱而言,隨著所裝填的填料平均粒徑的減小,分離度越高;但是對于某個特定的HPLC儀器,如果引起峰展寬的柱外效應足夠大,小粒徑色譜柱的高分離效果就不能實現。柱外峰展寬效應由填料本身以外的所有額外的體積引起,它們包括:

1、進樣體積,包括進樣環以及進樣閥內的額外體積

2、從進樣閥(器)出口到色譜柱入口的管路體積

3、保護柱內的間隙體積(保護柱如果有柱頭,還包括柱頭內體積)

4、在線過濾器內體積


上述均為柱外體積。因此,即便能夠做到把進樣量最小化,保持色譜柱入口前的管路盡可能短,內徑盡可能小。但如果色譜柱出口到檢測器的用了內徑0.2英寸的管路有1米長,譜帶展寬效應就可能會大到影響色譜分離的總體效果。所以,想要得到期望的分離效率,就要確保把HPLC體系的柱外效應減到最小。



誤區七:對于硅膠填料,殘留的硅醇基是造成拖尾的原因


觀點錯誤!特定條件下,硅膠基質鍵合柱上存在的硅醇基,尤其是在分析堿性物質時,能夠造成峰拖尾。拖尾的原因在于硅醇基團本身就是一個弱酸,pKa大約在4.5和4.7之間。因此如果流動相pH值在4到5的時候,硅醇就會離子化,并與諸如質子化的胺類等帶正電荷的分子通過靜電引力發生作用。可以通過將pH降到3以下來抑制硅醇基的離子化的方式盡量減小該種作用。但是對于許多堿性化合物,在低pH條件下也能夠發生拖尾。有經過特別設計的專門的反相色譜填料,對堿性化合物的測定,能獲得好的峰形。


三種原因能夠造成拖尾,化學問題、柱填充問題和色譜設備硬件問題。三種問題都可以造成拖尾,但是要解決問題,就需要找到問題的根源。詳細探究這三種原因超出了本文的范圍,這里就三種類型的問題分別舉幾個實例,使大家有一個大概的認識。


首先,除了硅醇基的作用外,化學因素的拖尾還有其它幾種方式。與金屬產生螯合作用的化合物與色譜填料中的痕量金屬作用引起的拖尾,在早期的硅膠基質中特別明顯。錯誤的進樣溶劑選擇能夠導致拖尾。樣品中不容易洗脫的強保留組分和流動相中的雜質在柱頭的逐步累積也可導致拖尾,這些在柱頭累積的物質能扮演不同的固定相角色,與經過的分析物作用而導致分析物峰形拖尾。有時,存在混合模式的保留作用也能夠誘發拖尾,如分析物與活性基團既有反相作用也有離子相互作用的情況。有時候,流動相pH選擇錯誤,樣品部分離子化,分子態和離子態共存,混合模式作用就能夠導致峰扭曲和拖尾。此外,一個大的色譜峰后面如恰好有一個洗脫出峰時間相差不大的的小峰,看上去也和拖尾一樣。


柱子的填充質量不好也可以導致拖尾。柱頭的填料空隙可以導致峰分叉或者拖尾。如果柱子沒有填充好,柱床上有微小的溝槽就能夠使峰形過寬。進樣濃度過大,樣品過載也會導致拖尾,樣品過載導致峰前延的情況更常見。如果樣品進得少了,因為過多的硅醇基存在,也能夠導致拖尾。


接下來來討論下儀器硬件問題導致拖尾的情況。前面說的管路死體積和接頭體積能夠導致拖尾。進樣時的瞬間加壓可以造成柱頭填料塌陷(有空洞形成)從而引起拖尾。反應比較慢的檢測器用來檢測快速洗脫出的分析物時會形成峰展寬和拖尾(和流通池厚度,長度有關)。前文說的柱操作溫度和流動相溫度不一致也會引起拖尾。所以說,造成HPLC拖尾的不總是硅醇基。



誤區八:硅膠填料只能夠在pH2到7使用


觀點錯誤!反相柱的化學毀壞機理通常有兩種:在低于pH2時,硅氧鍵的催化水解;在pH大于7或8的時候,硅膠被水中OH-離子溶解。


pH小于2的時候,-Si-O-Si-可以被水合氫離子H3O+進攻,固定相就會流失斷裂。隨著時間的推移,隨著載碳量下降保留值會慢慢下降。有三甲基氯硅烷等短鏈封端的色譜柱,由于封端試劑更易水解流失,這種現象更為明顯。長鏈C18固定相因為空間位阻效應,對于這樣一種流失有一定的保護作用,但是最終仍然是慢慢被侵蝕,尤其是溫度高于環境時。空間保護、高密度鍵合有助于防止硅膠鍵合相的流失。聚合固定相在這種條件下表現良好,但是比起硅膠固定相,其柱效要低。在高pH方面,一定需要有保護硅膠基體免于氫氧根離子進攻的措施。一旦溶解過程開始,隨著柱床內空洞出現,色譜柱會最終失效。所以開發了雙硅烷交聯C18(bidentate C18)、有機無機雜化顆粒以及聚合物包覆硅膠等耐高pH的特種色譜柱。這些柱子都使用了化學方法來保護固定相避免OH-的攻擊。上述的特種柱子能夠承受pH11-12的條件。在此堿性pH條件下,柱子要避免高溫使用。當然,聚合物色譜柱能夠在pH13甚至14的條件下使用,但是,前文已經指出,聚合物柱比硅膠柱柱效要差些。


因此,在這個論點上,特殊的硅膠柱能夠在pH2-7以外的范圍使用,但是普通硅膠色譜柱要格外小心,由其是在高溫條件下。


誤區九:當代HPLC柱至少應該承受1000次進樣


觀點錯誤!現代HPLC色譜柱能夠承受的進樣數量由許多因素決定。有些因素基于以下色譜作用的模式不同而不同:反相色譜,離子交換色譜,排阻色譜,正相色譜,手性色譜,親水交互色譜等等。有些因素基于不同的填料基體:硅膠基質,雜化基質,氧化鋯基質,聚合物基質,或者是凝膠和有一定交聯度的聚合物樹脂。有些因素基于固定相本身的一些特性:表面鍵合度、鍵合方式、聚合還是單層鍵合、或者是聚合物包覆。其他的因素和色譜應用條件有關:pH、溫度、流動相組成、緩沖液組成、流動速率、壓力等等。還有些和樣品有關:完全標樣、樣品潔凈度、樣品pH、樣品體積(含量)、樣品雜質、分析物分子本身特性等。如果一根柱子被濫用,比如在pH范圍外,或者流速范圍外,很有可能連50次進樣都成問題。如果樣品里都沒有強保留物質,5000次使用也不為過。如果色譜柱不在其承受力上限上連續使用,壽命會更長。如果柱子進樣的樣品繁雜,但是從來不沖洗除去柱子里的強保留物質,壽命必然減少。


通過對許多制藥公司訪問得到的經驗表明,絕大多數5μm反向色譜柱在分析制劑、簡單藥品混合物,和標樣的情況下能夠承受至少1000次進樣。如果樣品“很臟”,比如沒有進行過嚴格完全凈化生物樣品提取物,環境樣品提取物,這樣是達不到1000次進樣的。


所以說柱子能夠承受的次數不是絕對的,而是取決于柱子的類型,操作條件,樣品潔凈程度和柱子被濫用程度等。當然,使用保護柱或在線過濾器,柱子的壽命會延長。在很多個專業研討會上,作者通過對聽眾非正式的投票調查,結果表明:只有不到15%的使用者實際記錄了某支特定色譜柱能夠用的次數,很多色譜工作者并不真正知道每支色譜柱到底能夠使用多少次進樣。



誤區十:色譜柱總是應該緊緊的密封,以防被填料因與空氣接觸而損壞


觀點錯誤!通常色譜柱兩頭的微孔的直徑不到0.2英寸,所以在如此小的截面積的區域內,空氣進入和填料接觸以及色譜柱內溶劑蒸發所造成的損傷都十分微小。即使是有部分空氣進入色譜柱,也很難擴散通過致密的填料床,接觸足夠多的填料而造成損害。假若柱子中有了部分空氣,只要裝在色譜設備上運行一次,在高壓下會立即溶解,然后流出色譜柱,不會對后面的使用有任何危害。當然,如果你為了保險,死死的擰緊也行。大部分柱子都配備了帶螺紋的柱塞頭,手動就能夠擰緊,以防止溶劑蒸發,空氣進入填料。



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